AccuRapid™ Cloning Kit

Bioneer의 AccuRapid™ Cloning Kit는 1~3 조각의 insert (PCR product)를 선형화된 vector에 정확하고 신속하게 cloning 할 수 있는 제품입니다. 본 제품은 PCR로 증폭된 insert 말단과 선형화된 vector 양말단의 18 ~ 21 bp complementary sequence를 인식하여 연결하는 방법입니다. Insert (PCR product 또는 plasmid)에 제한효소를 처리한 후 ligation하는 방법과 달리, 제한효소 처리 대신에 cloning 하려는 insert를 PCR 증폭을 통해 빠르게 준비할 수 있으며, vector에 insert를 원하는 방향으로 정확히 cloning 할 수 있습니다. (당사의 세계 최고속 PCR장비, ramping rate 9.5℃/sec, AllInOneCycler™ 를 사용하면 매우 빠르게 증폭할 수 있습니다)

₩150,000
카탈로그 번호
K-7110-CFG

특장점

  • 빠르고 정확한 cloning

    30분 반응으로 빠르고 정확한 cloning

  • Insert에 제한효소를 처리하지 않고 vector에 원하는 방향으로 cloning 가능

    Vector 양 말단의 18 ~ 21 bp complementary sequence 포함한 primer 를 이용하여 insert를 증폭한 후 vector에 원하는 방향으로 cloning

  • 다양한 크기의 여러 개 insert를 동시에 cloning

    여러 조각 (1~3 조각) 의 insert를 각 조각의 양 말단 complementary sequence를 이용하여 원하는 순서로 동시에 cloning 가능

  • 손쉽게 원하는 형태로 vector 조작 가능

    손쉽게 cloning 디자인을 다양화하여 원하는 형태로 vector 조작 가능

Schematic protocol for AccuRapid ™ Cloning Kit

Kit 구성

AccuRapid ™ Cloning Kit Components K-7110 (10 rxns) K-7120 (20rxns) K-7130 (50rxns)
AccuRapid ™ Enzyme Mix 45 ul 45 ul x 2 45 ul x 5
2 kb pBHA Control Vector (25 ng/ul) 3 ul 5 ul 5 ul
750 bp Control Insert (50 ng/ul) 5 ul 8 ul 8 ul

실험 방법

1선형화된 vector 준비
AccuRapid ™ Cloning Kit를 사용하기 위해서는 제한효소 처리 또는 PCR을 이용하여 vector를 완벽히 선형화하는 것이 중요합니다.
완벽히 선형화된 vector로 실험을 진행해야 cloning 효율이 높아져, insert가 삽입되지 않은 원형 vector의 colony 형성은 줄어들고 insert가 삽입된 colony가 많이 형성됩니다.
* 클로닝 효율을 높이기 위해 제한효소 처리 후 전기영동을 통해 선형화된 vector 를 확인하고 다음 실험으로 진행하는 것을 권장합니다.

2Primer 디자인
Insert를 증폭하기 위한 primer는 선형화된 vector 양 말단의 18 ~ 21 bp complementary sequence를 포함하도록 디자인되어야 합니다.

3Insert 증폭
디자인 후 합성된 extension primer로 PCR을 수행하여 insert를 증폭합니다. (당사의 세계 최고속 PCR장비, AllInOneCycler™ 를 사용하면 매우 빠르게 증폭할 수 있습니다.) 그리고 PCR purification (AccuPrep® PCR Purification Kit, K-3034) 또는 전기영동 후 gel purification (AccuPrep® Gel Purification Kit, K-3035)을 수행하여 purified insert를 확보합니다.


4Cloning 반응
Cloning 반응을 위해 다음과 같이 반응물을 혼합하여 spin down 후 incubator 또는 PCR machine을 사용하여 50°C에서 30 분 동안 반응시킵니다. 반응이 끝나면 transformation을 수행할 때까지 얼음 또는 -20℃에 보관합니다.

Reaction mixture Positive control Negative control 1 ~ 3 Insert fragment
Linearized Vector
(25 ~ 50 ng/μl)
1 μl of 2 kb pBHA Control Vector

y μl
(25–50 ng vector)

y μl
(25–50 ng vector)

Purified PCR Fragment 1.5 μl of 750 bp Control Insert 0 μl x μl*
(70–150 ng Insert)
D.W. 3.5 μl 6 μl – y ul 6 - y – x μl
AccuRapid ™ Enzyme Mix 4 μl
Total 10 μl
반응 50°C, 30 min

* Purified PCR Fragment는 총 70~150 ng이 되도록 넣어줍니다. 농도에 따라 넣어주는 양이 달라질 수 있으나, 최대 6 - y μl까지 가능합니다.
ex) y = 1일 경우, 1 fragment: 5 μl, 2 fragments: 각 2.5 μl x 2, 3 fragments: 각 1.7 μl x 3


5Transformation 
카탈로그 번호 제품명 가격
K-7110 AccuRapid ™ Cloning Kit, 10 rxns ₩150,000
K-7120 AccuRapid ™ Cloning Kit, 20 rxns ₩260,000
K-7130 AccuRapid ™ Cloning Kit, 50 rxns ₩600,000

Primer 설계

AccuRapid ™ Cloning Kit를 사용하기 위해 insert는 증폭 하여야 하며, 사용되는 extension primer는 primer의 5’ end에 선형화된 vector 양 말단의 18 ~ 21 bp complementary sequence를 포함하도록 디자인되어야 합니다.


ex) NdeI(CATATG), XhoI(CTCGAG) enzyme site 로 cloning 하는 경우
3’ end vector sequence (Forward primer)



5’ end vector sequence (Reverse primer)



Insert sequence1


Insert sequence2


Insert sequence3



Name Sequence bp
Insert-1_FP
Insert-1_RP
Insert-2_FP
Insert-2_RP
Insert-3_FP
Insert-3_RP

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