MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit (5 reactions)

MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit는 자성분리방식으로 His-tagged protein을 간편하게 정제할 수 있는 제품으로, Ni-NTA Magnetic Nanobead와 His-tagged protein 정제에 필요한 buffer로 구성되어 있습니다. 평균직경 400 nm의 Magnetic Nanobead는 표면적이 넓고 결합력이 우수하여 높은 binding capacity를 나타내며, 강력한 자성력을 가지고 있어 손실 없이 빠르게 회수됨으로써 실험 시간을 줄이고 수율을 높입니다. Magnetic Nanobead 1 ml당 약 3-4 mg의 6x his-tagged protein이 결합할 수 있습니다.  

₩210,000
카탈로그 번호
K-7200

특장점

  • 신속한 정제

    His-tagged proteins을 빠르고 쉽게 정제할 수 있습니다.

  • 고순도

    결합력이 우수한 spherical shape magentic beads에 의해 고순도 단백질을 획득할 수 있습니다.

  • 효율성

    Crude cell lysate를 이용한 효율적인 screening 수행 가능합니다.

  • 다양한 샘플에 적용

    In vivo (E. coli 발현) 또는 In vitro (무세포 발현)로 발현된 His-tag을 갖고 있는 모든 재조합 단백질의 정제가 가능합니다.

제품 구성

구성품 규격 보관 온도
Ni-NTA magnetic silica resin 5 X 1 mL (10% slurry, v/v) 4°C
Binding/Washing buffer 100 mL
Elution buffer 15 mL
Neodymium magnet 3 ea
User's Guide 1 ea

실험 방법

세포가 파쇄된 sample을 미리 준비하고 본 kit의 manual에 맞게 진행하여 6x His-tagged protein을 정제 할 수 있습니다.

※ Note
1. 본 kit 안에 포함되어 있는 neodymium 자석을 사용하여 정제 할 수 있습니다.
2. 본 kit은 neodymium 자석을 사용하지 않고 centrifuge를 사용하여도 정제가 가능합니다.
3. Bioneer의 자성입자 정제장치인 MagListo™-2(TM-1010)를 사용하면, 한번에 8개의 sample을 더욱 쉽고 빠르게 정제 할 수 있습니다.

실험 결과

1. MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit를 이용한 단백질 정제

figure1

Figure 1. Purification of 6x His-tagged protein.
- M: Protein broad marker (Bioneer, D-2010)
- L: Loading sample
- 1: Unbound sample
- 2: Eluted sample


2. MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit을 이용하여 25 kDa - 94 kDa의 다양한 크기의 단백질을 정제

figure1

Figure 2. Protein size effect on purification.
- M : Protein broad marker (Bioneer, D-2010)
- 1 : Size 94 kDa his-tagged protein
- 2 : Size 67 kDa his-tagged protein
- 3 : Size 38 kDa his-tagged protein
- 4 : Size 27 kDa his-tagged protein
- 5 : Size 25 kDa his-tagged protein


3. 다른 회사의 magnetic bead 제품들과의 비교

figure1

Figure 3. Comparison with Other products.
- M : Protein broad marker (Bioneer, D-2010)
- L : Loading whole sample
- 1 : MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit (K-7200)
- 2 : Company A
- 3 : Company B
- 4 : Company C
- 5 : Company D


카탈로그 번호 제품명 가격
K-7200 MagListo™ His-tagged Protein Purification Kit, 1 x 5 ml ₩210,000

현재까지 10 kDa - 150 kDa 분자량 범위의 단백질을 합성한 결과를 가지고 있습니다. 10 kDa 이하 또는 150 kDa 이상의 것도 합성이 될 수 있지만 보증하지 않습니다.
AccuRapid™ Protein Synthesis Kit (Cat. No. K-7280, bioneer) 를 이용한 단백질 합성

Figure 1. SDS-PAGE data of various proteins synthesized from various templates
M: AccuRapid ™ Protein Size Marker (Broad) (Cat. No. D-2010, Bioneer)
1: CalmL3 (17.5 kDa)
2: DUSP3 (22 kDa)
3: CAT (24 kDa)
4: AcGFP (29 kDa)
5: ERFP (31 kDa)
6: EF-Ts (34 kDa)
7: VF (45 kDa)
8: BM3 (117 kDa)

합성 Kit에 따라 합성된 단백질을 획득하는 시간은 다릅니다. ExiProgen™ EC Protein synthesis Kit의 경우에는 6시간 이내에 합성된 단백질을 얻을 수 있습니다. 그 외 Kit에 대한 정보는 아래 표를 참고하시기 바랍니다. 또한, ExiProgen™ 으로부터 단백질 합성 후 최종 정제된 목적 단백질은 냉각 블록에서 저온상태 (4 - 8°C)로 유지됩니다. ExiProgen™을 Overnight으로 가동시킬 경우에도 별도의 냉장장치 없이 단백질을 안정하게 보관 가능합니다.

* 소량의 단백질 합성만을 원하시는 경우, 조절이 용이한 Manual Kit를 사용하시기 바랍니다.

Template DNA는 공통적으로 아래 그림과 같이 T7 promoter, RBS, His-tag과 T7 terminator의 구조를 가지고 있어야 합니다. His-tag을 붙이는 위치에 따라 2 종류로 제작을 하여 발현과 folding, 분리정제가 잘 되는 것을 선택할 수 있습니다. 이때에 template 형태는 plasmid DNA와 PCR product 두가지 중 선택할 수 있습니다. PCR product로 준비할 경우 빠르게 여러 종류의 template를 준비할 수 있는 장점이 있지만, 단백질 합성수율이 plasmid DNA에 비해 약간 떨어질 수도 있습니다. 특히 대량발현을 위해 장시간 반응시키는 SECF 방식을 사용할 경우 template의 안정성이 중요하므로 plasmid template를 권장합니다.

1) Plasmid DNA를 template로 사용할 경우in vitro translation 전용 vector인 pBIVT vector (Cat. No. K-7350, Bioneer) 에 클로닝하여 사용하는 것을 추천 드립니다. 그 외에도 T7 system과 RBS, 정제 목적의 His-tag을 갖춘 발현 vector도 사용할 수 있습니다. 클로닝된 plasmid DNA는 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit (Cat. No. K-3112, Bioneer)를 사용하면 10분 내에 고순도, 고농도의 plasmid DNA가 추출이 되어 편리하게 준비할 수 있습니다.

2) PCR product를 template로 사용할 경우ExiProgen™ ProXpress PCR Template Kit (Cat. No. K-7400, Bioneer)를 사용하면 목적 유전자를 PCR로 증폭하여 클로닝 과정 없이 많은 수의 template를 손쉽게 준비할 수 있습니다. 준비된 template DNA의 순도는 A260/280 ratio가 1.8 - 2.0 범위에 있는 것을 사용해야 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 

단백질 합성에 사용되는 template DNA의 양은 단백질 합성수율에 영향을 미치므로 적정량의 template를 사용하여야 합니다. 사용되는 template는 copy 수가 중요하므로 DNA 크기에 비례하여 정량적으로 넣어 주어야 합니다. 일반적으로 plasmid DNA의 경우 1 kb 당 1.34 ug/ml을 사용하며, PCR product의 경우에는 1 kb 당 670 ng/ml을 사용합니다. 자세한 내용은 Question 2)의 답변을 참고 하십시오.

예) ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit (Cat. No. K-7300, Bioneer)는 단백질 발현 반응에 0.75 ml를 사용하고 있어, 5 kb의 plasmid DNA 사용 시 5 ug/reaction을 준비합니다.
최적의 단백질 합성을 원하시는 경우 template DNA를 농도별로 단백질 발현량을 스크리닝 하는 실험을 추천 드립니다.

단백질 합성 키트는 E. coli 기반 발현 시스템이기 때문에 E. coli codon으로 최적화된 DNA의 경우 단백질의 합성량과 성공률이 높아질 수 있습니다.

ExiProgenTM에서 사용하고 있는 정제방법은 바이오니아의 자체 특허기술로 만들어진 평균 직경 400 nm의 자성체 나노비드를 이용합니다. 자성체 나노비드 표면에 Ni-NTA가 고정화되어 있어서 목적 단백질의 His-tag에 강하게 결합하는 affinity purification 방법으로부터 단백질을 정제하게 됩니다. 이러한 정제과정은 ExiProgenTM 안에서 전자동으로 이루어집니다.

단백질의 3차 구조로 인해 N-말단이나, C-말단에 위치한 His-tag이 외부로 노출되지 않아 단백질의 정상적인 folding을 방해하거나 일부만 노출될 경우에 Ni-NTA는 His-tag을 인지하지 못하여 정제 효율이 낮을 수 있습니다. 그러므로 단백질 합성을 위한 template을 설계할 때 단백질구조를 확인하여 단백질의 표면으로 노출된 말단에 His-tag을 부착하여야 합니다. 단백질 구조가 알려지지 않은 경우에는, His-tag의 위치를 N-말단과 C-말단에 위치한 것을 동시에 준비하여 발현과 정제가 잘 되는 것을 찾아야 합니다. 양쪽 말단에서 모두 발현정제가 안되는 경우 His-tag의 histidine의 개수를 늘려주는 방법으로 발현 및 정제 효율을 개선할 수 있습니다.

이런 방법으로도 발현정제가 안되는 경우에는 N-말단에 발현을 도와주는 단백질을 붙여서 soluble fusion 단백질을 만들어서 발현, 정제할 수 있습니다. 바이오니아에서는 효율이 좋은 발현 시스템을 지속적으로 개발하고 있으니 발현이 실패할 경우 회사로 문의해주시기 바랍니다.

대부분의 경우에는 단백질의 발현이 잘 되지 않아서 발생하는 문제입니다. Manual 키트인 AccuRapid™ 키트를 사용하여 적은 스케일로 template 최적화 과정을 통해 최적의 발현조건을 찾아서 ExiProgen™에서 같은 조건으로 running 시키면 단백질을 많이 얻을 수 있습니다. 그리고, 발현량은 많으나 정제효율이 낮을 경우 Question 7) 과 같이 His-tag의 위치 변화를 통해 정제 효율을 증가시킬 수도 있습니다.

각각의 ExiProgenTM 단백질 합성 키트들은 2개의 박스, Kit ①과 Kit ②로 구성되어 있습니다.

Purification Kit (Kit ①)는 4℃ - 8℃, Expression Kit (Kit ②)는 -20℃ - -70℃에 각각 보관합니다. 장기보존시 Expression Kit (Kit ②) 내의 E. coli extract는 -70℃ 보관을 권장합니다. 제품 박스와 매뉴얼에 표기되어 있으니 참조하시기 바랍니다.

Cartridge는 4분할 사용까지 성능을 보장하고 있습니다. 4분할 사용을 원할 경우 overnight 사용은 권장하지 않으며, ExiProgen™ 구동 후 cartridge는 바로 권장온도에 보관해 주시기 바랍니다. Cartridge 커버를 덮은 상태로 cartridge ①은 4℃ - 8℃, cartridge ②는 -20℃ - -70℃에 보관하시기 바랍니다.

E. coli extract는 냉동과 해동을 반복할 경우, 성능이 저하됩니다. 튜브에 1회분으로 포장되어 있으니, Kit 구성품을 확인하시고 실험 계획에 맞게 사용하시기 바랍니다.

기타 궁금하신 사항은 sales@bioneer.co.kr 로 문의하여 주시기 바랍니다.

바이오니아의 재조합단백질 합성 및 정제에 관련된 제품군은 아래와 같이 분류되며, 용도에 따라서 선택이 가능합니다. 

Exiprogen™ 데모 신청은 sales@bioneer.co.kr 로 문의하여 주시기 바랍니다.

과정제품 종류사용 장비서비스

DNA Template

준비

template proN-His primer C-His primer Plasmid PCR kit

단백질

합성 / 정제 / 투석

synthesis purification dialysis Mini Midi Maxi Mega K-7340 Normal Normal Disulfide Bond K-7290 Maxi Disulfide Bond Tagfree Dialysis His-tag His tag GST-fusion K-7740 Protein A Protein G Protein L
 
 

 
 
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