ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit

ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit는 바이오니아에서 개발한 세계 최초의 전자동 단백질합성 장비인 ExiProgen™ 에서 단백질을 합성할 수 있는 제품입니다. Template DNA 를 첨가한 kit 를 ExiProgen™에 장착한 후, Protocol No. 902 를 가동시키면 6시간 내에 전자동으로 단백질을 발현하고 발현된 목적단백질을 His-tag를 이용하여 정제합니다. 1회 반응으로 최대 16종의 서로 다른 단백질을 고순도로 100 µg 까지 얻을 수 있으며, 실험 환경에 따라서 상이한 결과를 얻을 가능성이 있는 매뉴얼 방법과는 달리 재현성 높은 결과를 얻을 수 있습니다.

Application Note

• Fluorescenct proteins

• High molecular weight protein

in vivo protein expression pET vectors


₩650,000
카탈로그 번호
K-7300-CFG

특장점

  • 완전 자동화 시스템

    Template DNA 를 카트리지에 넣어준 후, ExiProgen™에 장착하여 가동시키면 전자동으로 단백질 합성 및 정제가 되어 약 6시간 이내에 목적 단백질을 얻을 수 있습니다.

  • 고난이도 발현 단백질 합성

    기존의 in vivo 방식으로 발현이 어려웠던 세포 독성 단백질, 막단백질 등의 단백질 합성도 가능합니다.

  • 다양성

    다양한 종류의 DNA (plasmid 또는 PCR product)로 부터 다양한 크기 (10 kDa ~150 kDa)의 단백질 합성이 가능합니다.

  • 재현성

    자동화 장비의 최적화된 프로토콜로부터 재현성있게 단백질 획득이 가능합니다.

제품 구성

구성품 보관 온도
Kit-1
(Purification kit)
Cartridge ①  4℃
Disposable filter tip
Manual
Kit-2
(Expression kit)
Cartridge ② -20℃
(E. coli extract는 -70℃이하 권장)
Positive control DNA (1.5mL tube)
*E. coli extract (8 strip tube)
Elution tube and cap













*E. coli extract (8 strip tube): T7 RNA polymerase 와 ribosome 등이 포함되어 수령 즉시 -70℃이하 온도에서 보관을 권장합니다. 냉동과 해동 반복 시 성능이 저하됩니다.


제품 원리

본 제품은 단백질 발현 및 정제방법을 자동화 장비에 적용시킨 키트로써, 그 원리는 아래의 그림과 같습니다.

· 상단 패널: Manual method – 순차적으로 진행되나 손이 많이 감
· 하단 패널: Automated method – DNA 추가 후 시작 버튼으로 간편하게 구동


· Template DNA 구조: ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit 의 발현을 위한 template DNA (plasmid DNA 또는 PCR product) 는 아래 그림중 하나의 구조를 가지고 있어야 합니다.

 
   
· 단백질 발현 조건 최적화: 단백질 합성양을 최대화 하기 위해서는 각 DNA별 최적 농도를 찾아야 하며, 이를 위해서는 아래와 같은 실험을 선행하여야 합니다.

 

실험 방법

실험 결과

· 재현성 : 동일한 시료에 대해서 동시에 16개의 반응을 진행할 수 있으며, 반응 well 사이의 편차가 없습니다.

Figure 1. CAT 단백질 발현 및 정제 
Lane 1~16: well 번호, M: AccuLadder™ Protein Size Marker (Low), E: 발현 샘플, P: 정제 샘플


기타 실험 결과는 상단에 위치한 Application_Note에서 확인하실 수 있습니다.


Manual

Manual_ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit


MSDS

MSDS_ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit_Binding Washing buffer

MSDS_ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit_E. coli extract

MSDS_ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit_Elution buffer

MSDS_ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit_Master mix


Brochure

ExiProgen™ protein systhesis and nucleic acid extraction system


Quality Assurance

Bioneer is the holder of Quality Management System Certificates for the following standards.

ISO 9001 – certificate

EN ISO 13485 - certificate

바이오니아 ExiProgen™ 을 이용한 논문 리스트

발행연도  논문 제목 저자 논문 정보
2018 Highly efficient genome editing by CRISPR-Cpf1 using CRISPR RNA with a uridinylate-rich 3′-overhang Bin Moon S, Lee JM, Kang JG, Lee NE, Ha DI, Kim DY, Kim SH, Yoo K, Kim D, Ko JH, Kim YS Nat Commun. 2018 Sep 7;9(1):3651.
2018 Receptor-mediated dimerization of JAK2 FERM domains is required for JAK2 activation. Ryan D Ferrao, Heidi JA Wallweber, Patrick J Lupardus Elife. 2018 Jul 25;7.
2018 Selectively Modulating Conformational States of USP7 Catalytic Domain for Activation. Özen A, Rougé L, Bashore C, Hearn BR, Skelton NJ, Dueber EC Structure. 2018 Jan 2;26(1):72-84.
2016 The OsCYP19-4 Gene Is Expressed as Multiple Alternatively Spliced Transcripts Encoding Isoforms with Distinct Cellular Localizations and PPIase Activities under Cold Stress. Lee A, Lee SS, Jung WY, Park HJ, Lim BR6 Kim HS, Ahn JC, Cho HS Int J Mol Sci. 2016 Jul 19;17(7).
2016 The role of MscL amphipathic N terminus indicates a blueprint for bilayer-mediated gating of mechanosensitive channels. Bavi N, Cortes DM, Cox CD, Rohde PR, Liu W, Deitmer JW, Bavi O, Strop P, Hill AP, Rees D, Corry B, Perozo E, Martinac B Nat Commun. 2016 Jun 22;7:11984.
2016 Removal of the mechanoprotective influence of the cytoskeleton reveals PIEZO1 is gated by bilayer tension. Cox CD, Bae C, Ziegler L, Hartley S, Nikolova-Krstevski V, Rohde PR, Ng CA, Sachs F, Gottlieb PA, Martinac B Nat Commun. 2016 Jan 20;7:10366.
2016 Overexpression of OsCYP19-4 increases tolerance to cold stress and enhances grain yield in rice (Oryza sativa L.) Yoon DH, Lee SS, Park HJ, Lyu JI, Chong WS, Liu JR, Kim BG, Ahn JC, Cho HS J Exp Bot. 2016 Jan;67(1):69-82.
2015 Development of a Recombinant Protein Vaccine Based on Cell-Free Protein Synthesis for Sevenband Grouper Epinephelus septemfasciatus Against Viral Nervous Necrosis. Kim JO, Kim JO, Kim WS, Oh MJ J Microbiol Biotechnol. 2015 Oct;25(10):1761-7.
카탈로그 번호 제품명 가격
K-7300 ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit, 16 reactions ₩650,000
K-7301 ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit, 32 reactions ₩1,100,000
K-7302 ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit, 96 reactions ₩2,700,000

현재까지 10 kDa - 150 kDa 분자량 범위의 단백질을 합성한 결과를 가지고 있습니다. 10 kDa 이하 또는 150 kDa 이상의 것도 합성이 될 수 있지만 보증하지 않습니다.

AccuRapid™ Protein Synthesis Kit (Cat. No. K-7280, bioneer) 를 이용한 단백질 합성

Figure 1. SDS-PAGE data of various proteins synthesized from various templates
M: AccuRapid™ Protein Size Marker (Broad) (Cat. No. D-2010, Bioneer), 1: CalmL3 (17.5 kDa), 2: DUSP3 (22 kDa), 3: CAT (24 kDa), 4: AcGFP (29 kDa), 5: ERFP (31 kDa), 6: EF-Ts (34 kDa), 7: VF (45 kDa), 8: BM3 (117 kDa)

합성 Kit에 따라 합성된 단백질을 획득하는 시간은 다릅니다. ExiProgen™ EC Protein synthesis Kit의 경우에는 6시간 이내에 합성된 단백질을 얻을 수 있습니다. 그 외 Kit에 대한 정보는 아래 표를 참고하시기 바랍니다. 또한, ExiProgen™ 으로부터 단백질 합성 후 최종 정제된 목적 단백질은 냉각 블록에서 저온상태 (4 - 8°C)로 유지됩니다. ExiProgen™을 Overnight으로 가동시킬 경우에도 별도의 냉장장치 없이 단백질을 안정하게 보관 가능합니다.

* 소량의 단백질 합성만을 원하시는 경우, 조절이 용이한 Manual Kit를 사용하시기 바랍니다.

Template DNA는 공통적으로 아래 그림과 같이 T7 promoter, RBS, His-tag과 T7 terminator의 구조를 가지고 있어야 합니다. His-tag을 붙이는 위치에 따라 2 종류로 제작을 하여 발현과 folding, 분리정제가 잘 되는 것을 선택할 수 있습니다. 이때에 template 형태는 plasmid DNA와 PCR product 두가지 중 선택할 수 있습니다. PCR product로 준비할 경우 빠르게 여러 종류의 template를 준비할 수 있는 장점이 있지만, 단백질 합성수율이 plasmid DNA에 비해 약간 떨어질 수도 있습니다. 특히 대량발현을 위해 장시간 반응시키는 SECF 방식을 사용할 경우 template의 안정성이 중요하므로 plasmid template를 권장합니다.

1) Plasmid DNA를 template로 사용할 경우in vitro translation 전용 vector인 pBIVT vector (Cat. No. K-7350, Bioneer) 에 클로닝하여 사용하는 것을 추천 드립니다. 그 외에도 T7 system과 RBS, 정제 목적의 His-tag을 갖춘 발현 vector도 사용할 수 있습니다. 클로닝된 plasmid DNA는 AccuPrep® Nano-Plus Plasmid Mini Extraction Kit (Cat. No. K-3112, Bioneer)를 사용하면 10분 내에 고순도, 고농도의 plasmid DNA가 추출이 되어 편리하게 준비할 수 있습니다.

2) PCR product를 template로 사용할 경우ExiProgen™ ProXpress PCR Template Kit (Cat. No. K-7400, Bioneer)를 사용하면 목적 유전자를 PCR로 증폭하여 클로닝 과정 없이 많은 수의 template를 손쉽게 준비할 수 있습니다. 준비된 template DNA의 순도는 A260/280 ratio가 1.8 - 2.0 범위에 있는 것을 사용해야 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 

단백질 합성에 사용되는 template DNA의 양은 단백질 합성수율에 영향을 미치므로 적정량의 template를 사용하여야 합니다. 사용되는 template는 copy 수가 중요하므로 DNA 크기에 비례하여 정량적으로 넣어 주어야 합니다. 일반적으로 plasmid DNA의 경우 1 kb 당 1.34 ug/ml을 사용하며, PCR product의 경우에는 1 kb 당 670 ng/ml을 사용합니다. 자세한 내용은 Question 2)의 답변을 참고 하십시오.
예) ExiProgen™ EC Protein Synthesis Kit (Cat. No. K-7300, Bioneer)는 단백질 발현 반응에 0.75 ml를 사용하고 있어, 5 kb의 plasmid DNA 사용 시 5 ug/reaction을 준비합니다.
최적의 단백질 합성을 원하시는 경우 template DNA를 농도별로 단백질 발현량을 스크리닝 하는 실험을 추천 드립니다.
단백질 합성 키트는 E. coli 기반 발현 시스템이기 때문에 E. coli codon으로 최적화된 DNA의 경우 단백질의 합성량과 성공률이 높아질 수 있습니다. 
ExiProgenTM에서 사용하고 있는 정제방법은 바이오니아의 자체 특허기술로 만들어진 평균 직경 400 nm의 자성체 나노비드를 이용합니다. 자성체 나노비드 표면에 Ni-NTA가 고정화되어 있어서 목적 단백질의 His-tag에 강하게 결합하는 affinity purification 방법으로부터 단백질을 정제하게 됩니다. 이러한 정제과정은 ExiProgenTM 안에서 전자동으로 이루어집니다.
단백질의 3차 구조로 인해 N-말단이나, C-말단에 위치한 His-tag이 외부로 노출되지 않아 단백질의 정상적인 folding을 방해하거나 일부만 노출될 경우에 Ni-NTA는 His-tag을 인지하지 못하여 정제 효율이 낮을 수 있습니다. 그러므로 단백질 합성을 위한 template을 설계할 때 단백질구조를 확인하여 단백질의 표면으로 노출된 말단에 His-tag을 부착하여야 합니다. 단백질 구조가 알려지지 않은 경우에는, His-tag의 위치를 N-말단과 C-말단에 위치한 것을 동시에 준비하여 발현과 정제가 잘 되는 것을 찾아야 합니다. 양쪽 말단에서 모두 발현정제가 안되는 경우 His-tag의 histidine의 개수를 늘려주는 방법으로 발현 및 정제 효율을 개선할 수 있습니다. 
이런 방법으로도 발현정제가 안되는 경우에는 N-말단에 발현을 도와주는 단백질을 붙여서 soluble fusion 단백질을 만들어서 발현, 정제할 수 있습니다. 바이오니아에서는 효율이 좋은 발현 시스템을 지속적으로 개발하고 있으니 발현이 실패할 경우 회사로 문의해주시기 바랍니다.
대부분의 경우에는 단백질의 발현이 잘 되지 않아서 발생하는 문제입니다. Manual 키트인 AccuRapid™ 키트를 사용하여 적은 스케일로 template 최적화 과정을 통해 최적의 발현조건을 찾아서 ExiProgen™에서 같은 조건으로 running 시키면 단백질을 많이 얻을 수 있습니다. 그리고, 발현량은 많으나 정제효율이 낮을 경우 Question 7) 과 같이 His-tag의 위치 변화를 통해 정제 효율을 증가시킬 수도 있습니다.
각각의 ExiProgenTM 단백질 합성 키트들은 2개의 박스, Kit ①과 Kit ②로 구성되어 있습니다.

Purification Kit (Kit ①)는 4℃ - 8℃, Expression Kit (Kit ②)는 -20℃ - -70℃에 각각 보관합니다. 장기보존시 Expression Kit (Kit ②) 내의 E. coli extract는 -70℃ 보관을 권장합니다. 제품 박스와 매뉴얼에 표기되어 있으니 참조하시기 바랍니다.

Cartridge는 4분할 사용까지 성능을 보장하고 있습니다. 4분할 사용을 원할 경우 overnight 사용은 권장하지 않으며, ExiProgen™ 구동 후 cartridge는 바로 권장온도에 보관해 주시기 바랍니다. Cartridge 커버를 덮은 상태로 cartridge ①은 4℃ - 8℃, cartridge ②는 -20℃ - -70℃에 보관하시기 바랍니다.
E. coli extract는 냉동과 해동을 반복할 경우, 성능이 저하됩니다. 튜브에 1회분으로 포장되어 있으니, Kit 구성품을 확인하시고 실험 계획에 맞게 사용하시기 바랍니다.

기타 궁금하신 사항은 sales@bioneer.co.kr 로 문의하여 주시기 바랍니다.

바이오니아의 재조합단백질 합성 및 정제에 관련된 제품군은 아래와 같이 분류되며, 용도에 따라서 선택이 가능합니다. 

Exiprogen™ 데모 신청은 sales@bioneer.co.kr 로 문의하여 주시기 바랍니다.

과정제품 종류사용 장비서비스

DNA Template

준비

template proN-His primer C-His primer Plasmid PCR kit

단백질

합성 / 정제 / 투석

synthesis purification dialysis Mini Midi Maxi Mega K-7340 Normal Normal Disulfide Bond K-7290 Maxi Disulfide Bond Tagfree Dialysis His-tag His tag GST-fusion K-7740 Protein A Protein G Protein L
 
 

 
 
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