S. pombe Validation Primer set ver 3.0 to ver 5.0 Upgrade Pkg (940 primers)

Yeast genome-wide knockout library는 특정 효모 유전자들의 기능이 결손된 돌연변이 효모 세트로 분열효모 (S.pombe) 전체 게놈의 약 98.5% 유전자를 타겟으로 한 변이체들로 구성되어 있습니다. 유전자 기능결손 변이체들은 상동 유전자 재조합 방법을 이용하여 표적유전자 대신 항생제 저항성 유전자와 바코드를 삽입하여 제작되었으며, 순서는 아래와 같습니다.

  • 표적유전자 선택: 효모 게놈에서 표적유전자를 식별합니다 (Shizosaccharomyces pombe).
  • DNA 카세트 준비: 상동성 재조합을 통해 효모 표적유전자와 재조합 될 DNA 카세트를 준비합니다. DNA 카세트에 양쪽 측면영역에는 재조합 표적유전자 ORF (open reading frame)이 존재하며, 그 사이에 녹아웃 균주 선발을 위한 제네티신 (G418) 저항성 유전자 (KanMX) 카세트, 그리고 각 변이체 동정을 위한 고유의 바코드 서열이 포함되어 있습니다.
  • 효모 형질전환: 형질전환 기술을 활용하여 DNA 카세트를 효모 세포에 넣습니다. 효모 세포에 들어간 DNA 카세트는 게놈상의 표적유전자 측면영역의 상동서열을 인식한 후 해당 위치로 삽입됩니다. 이때 표적유전자 ORF는 제거되기 때문에 효모에서 기능을 할 수 없게 됩니다. 또한 동시에 DNA 카세트가 삽입된 효모 세포는 G418 저항성을 갖게 됩니다.
  • 녹아웃 균주 선별: 형질전환된 효모는 G418이 포함된 배지에서 성장시켜 녹아웃 효모만을 선별합니다. 이 과정은 모든 표적유전자에 대해 반복되며, 마지막으로 모든 녹아웃 균주를 하나의 세트로 준비하여 라이브러리로 제공합니다.

S.pombe는 30℃의 온도에서 생육하며, 주요 배지 조성은 아래와 같습니다.

  • YES for General culture and maintenance medium
    Component Amt Final conc.
    Yeast extract 5 g/L 0.5% w/v
    Glucose 30 g/L 3.0% w/v
    Supplements: 225 mg/L adenine, uracil, leucine
    Solid media is made by adding 2% Bacto Agar
  • S.pombe knock-out library 균주는 KanMX4 유전자를 가지고 있으므로 G418 (100 mg/L)을 포함한 배지에서 선별할 수 있습니다.

먼저, 배수성과 유전자형의 정의는 아래와 같습니다.

  • 배수성 (Ploidy)
    • 이배체 (diploid): 이배체 세포에는 두 세트의 염색체(2n)가 있습니다. 이는 일반적으로 각 염색체에 대해 두 개의 복사본이 있고 각 부모로부터 하나씩 물려받은 것을 의미합니다.
    • 반수체 (haploid): 반수체 세포에는 단일 세트의 염색체(n)가 있습니다. 반수체 효모 세포는 일반적으로 교배 사건이나 특정 유전적 조작을 통해 발생합니다.
  • 유전자형 (Genotype)
    • 이형접합성 (heterozygous): 상이한 대립유전자를 갖는 것을 의미하며, 이배체 세포의 경우 두 개의 서로 다른 대립유전자가 있는 것입니다. 그리고 하나의 대립 유전자는 각 부모로부터 나옵니다.
    • 동형접합성 (homozygous): 동일한 대립유전자를 갖는 것을 의미하며, 이배체 세포의 경우 2개의 동일한 대립유전자를 갖는 것입니다. 반면, 반수체 세포에서는 대립유전자가 항상 하나이기 때문에 동형접합성으로만 존재합니다.

효모는 다양한 교배 유형을 가질 수 있습니다 (예: MATa 및 MATα). 이형접합성 이배체 (heterozygous diploid)는 적합한 반수체 (haploid) 균주 (예: MATa 및 MATα)를 교배하여 형성될 수 있습니다. 또한 이배체 효모 세포는 특정 조건에서 감수분열을 겪을 수 있으며, 그 결과 4개의 반수체 포자가 형성될 수 있습니다.

즉, heterozygous diploid 균주는 이배체 이형접합성 균주로 2n의 염색체이며, 두 대립유전자 중 하나는 정상이지만 다른 하나의 유전자가 결손 (deletion)되어 있는 것입니다. 바이오니아 heterozygous diploid 균주의 표적유전자는 필수 유전자 (essential gene)과 비필수 유전자 (non-essential gene)를 모두 포함하고 있습니다 (4,845 균주). 반면, homozygous haploid (동형접합성 반수체) 균주는 하나의 대립유전자를 갖는 n 염색체의 균주입니다. 바이오니아 homozygous haploid 균주의 표적유전자는 비필수 유전자 (non-essential gene)로만 구성되어 있습니다 (3,497 균주).

Agar type와 glycerol type은 배양된 효모의 보관 조건입니다.

  • Agar (한천) type: 효모 균주를 미리 제조된 영양분이 풍부한 고체배지에 배양하여 보관하는 방식으로 agar는 액체형태의 배지를 고형화 시키는 역할을 합니다. Agar type의 균주는 30℃에서 배양 후 생장을 억제하기 위해 4℃에 보관합니다.
  • Glycerol (글리세롤) type: 액체배양된 균주에 glycerol를 30% (v/v)로 처리하여 동결보존 (-70℃) 할 수 있도록 하는 보관 조건입니다. Glycerol은 세포 내 물분자와 결합하여 낮은 온도에서도 얼음결정 생성을 억제하여 cell을 보호하는 cryoprotectant 역할을 합니다.

바이오니아에서 효모균주 주문 시, shipping type으로 아래와 같이 agar type 및 glycerol type 중 선택하실 수 있습니다.

  • Agar type: Rich medium + supplements solid medium (2.0 microtube)
  • Glycerol type: Rich medium + supplements + 30% glycerol liquid medium (2.0 microtube)
Cat. No. Pack size Shipping temperature
가로 (cm) 세로 (cm) 길이 (cm) 제품무게 (kg) 드라이아이스 포함무게 (kg) 총 무게 (kg)
M-1010 (Agar type) 22.5 16.5 5.8 0.158 - 0.158 상온
M-1010 (Glycerol type) 5.4 4.5 5 0.049 10 10.049 냉동

*Glycerol type은 냉동 배송으로 dry ice비용이 추가됩니다.

일반적으로 DNA 바코드는 생물 종을 식별하기 위한 특정 DNA 서열을 의미합니다. 이와 유사한 의미로 Yeast genome-wide knockout library에서의 DNA 바코드도 라이브러리를 구성하는 표적유전자 녹아웃 균주들의 고유 DNA 서열을 의미합니다. 따라서 DNA 바코드는 DNA sequencing을 활용하여 녹아웃 균주를 동정할 때 사용될 수 있습니다.

Schizosaccharomyces pombe (S.pombe)와 Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae)는 모두 모델 생물로 널리 사용되는 효모이지만, 각기 다른 연구 장점을 가지고 있습니다. S.pombe를 사용한 연구의 장점은 다음과 같습니다.

  • 세포 주기 연구
    • G2/M 전이: S.pombe는 S.cerevisiae보다 G2 단계가 길어 세포 주기의 G2/M 전이를 연구하는 데 더 유리합니다. 인간 세포도 G2 단계가 상대적으로 길기 때문에, S.pombe는 인간 세포 주기 연구에 더 적합합니다. Cdc25 및 Cdk1과 같은 주요 조절 단백질은 S.pombe에서 처음 발견되고 특성화되었습니다.
    • 유사성: S.pombe의 세포 주기 조절 메커니즘이 인간 세포와 유사하여, 세포 주기 조절에 관련된 유전자와 단백질의 기능을 연구하는 데 이상적입니다.
  • 염색체 구조 및 분리
    • 염색체 구조: S.pombe는 동원체 (centromere) 구조와 텔로미어 (telomere) 구조가 인간 세포와 유사합니다. 이는 염색체 분리와 유지 연구에 중요한 모델이 됩니다.
    • 유사 염색질 (chromatin): S.pombe는 이질 염색질과 유사 염색질 모두를 포함하고 있어 염색질 리모델링과 관련된 연구에 유용합니다.
  • 세포 분열
    • 미세소관 형성: S.pombe는 중심체 (centrosome)가 아닌 방추극체 (spindle pole body)를 이용하여 미세소관을 형성합니다. 이는 식물과 일부 동물 세포와 유사하여, 세포분열 연구에 있어 다양한 모델로 사용될 수 있습니다.
    • 세포판 형성: S.pombe는 세포 분열 시 세포판을 형성하여 딸세포로 나뉩니다. 이는 식물 세포와 유사한 방식입니다.
  • 유전자 발현 및 조절
    • 유전자 발현 연구: S.pombe는 유전자 발현과 조절 메커니즘 연구에 적합한 시스템을 제공합니다. 특히 전사 조절과 염색질 구조 변화에 관한 연구가 용이합니다. 특히 유전자 발현 RNAi pathway는 S.cerevisiae에는 존재하지 않지만 S.pombe에는 기능하는 것으로 보고 되어있습니다.

Schizosaccharomyces pombe 게놈 데이터베이스는 PomBase (https://www.pombase.org/)에서 찾아볼 수 있습니다.

PomBase는 다음을 포함하여 S.pombe 연구를 위한 포괄적인 데이터 및 도구 모음을 제공합니다.

  • 게놈 서열 및 주석: 전체 S.pombe 게놈 서열, 유전자 모델 및 기능적 주석에 액세스합니다.
  • 유전 정보: 선별된 정보와 돌연변이 컬렉션을 통해 유전자 기능, 표현형 및 상호 작용을 탐색합니다.
  • 발현 데이터: RNA-seq 및 마이크로어레이 데이터를 이용하여 다양한 조건에서의 유전자 발현 패턴을 분석합니다.
  • 단백질 정보: S.pombe 단백질의 단백질 서열, 구조 및 기능 정보를 제공합니다.
  • 도구 및 리소스: 서열 분석, 유전자 상동성 검색 및 실험 설계를 위한 다양한 도구를 활용합니다.

S.pombe 유전자의 human ortholog gene을 찾는 데 두 가지 주요 방법이 있습니다.

  1. PomBase 사용: 대표적 S.pombe 게놈 데이터베이스인 PomBase는 human ortholog gene을 찾는 데 필요한 리소스를 제공합니다.
    • PomBase에서 관심 있는 S.pombe 유전자의 유전자 페이지로 이동합니다. 검색창을 이용하여 이름이나 유전자 ID로 유전자를 검색할 수 있습니다.
    • "Orthologs" 섹션을 클릭합니다. 이 섹션은 유전자 페이지 레이아웃에 따라 유전자 요약 내 또는 전용 "Orthologs" 탭 아래에 위치할 수 있습니다.
  2. 서열 유사성 기반 탐색: S.pombe 유전자에 대해 human ortholog gene을 찾을 수 없는 경우, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)와 같은 서열 유사성 검색 도구를 활용할 수 있습니다.
    • 관심있는 S.pombe 유전자의 DNA 혹은 단백질 서열을 알아야 합니다. 이 정보는 연구를 통해 확보하거나 PomBase 혹은 NCBI 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/search/)에서 유전자 ID를 사용하여 확인할 수 있습니다.
    • 다음 NCBI BLAST 페이지에 접속한 후 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 보유한 DNA 서열 (nucleotide)이나 단백질 (protein) 서열을 활용할 수 있도록 blastn, blastp 혹은 blastx를 선택합니다. 그리고 “Organism” 탭에서 “homo sapiens”를 선택한 후 화면 아래의 BLAST를 클릭합니다.
    • BLAST 결과에서 S.pombe 서열과 가장 서열 유사성이 높은 human ortholog 서열이 가장 낮은 E-value와 함께 결과 최상단에 위치합니다.

본 제품은 총 940 primer, 2 set로 구성되어 있으며, S. pombe haploid deletion mutants ver 3.0 to ver 5.0 Upgrade Pkg의 품질을 PCR로 확인할 때 사용되는 primer 제품으로서, target gene에 대한 특이적 primer deletion cassette KanMX module에 대한 common primer가 혼합된 상태로 구성되어 한 번의 pipetting만으로 PCR mixture를 손쉽게 준비할 수 있습니다.

₩1,600,000
카탈로그 번호
M-3030P-U5

특장점

  • S.pombe 각각의 유전자의 deletion mutants로 구성

  • 포유 동물과 생리학적인 프로세스 유사

  • 인체 암 유전자와 30% 이상의 상동성

  • 세포 주기가 짧아 (~3h) 분자생물학적인 작용 기전 및 pathway 연구에 용이

  • 열성 형질에 따른 phenotype 분석이 가능

  • functional complementation을 바탕으로 알려지지 않은 유전자 기능 분석이 가능

  • 살아있는 세포 기반의 대용량 약물 작용점 스크리닝에 이용 가능

개요

분열효모 게놈 적중 라이브러리는 바이오니아, 한국생명공학연구원 (KRIBB) 및 영국 왕립 암연구소 (Cancer Research UK)의 공동 연구로 개발되었으며(Nature Biotech., 2010), 바이오니아가 독점 사업권을 가지고 있습니다. 분열효모 게놈 적중 라이브러리는 유전체 수준의 유전자 기능 분석, 약물 작용점 규명 및 검증 연구, 총괄적인 세포 기능 연구를 대상으로 한 강력한 연구 수단입니다. 또한, 유전자 발현 및 합성치사(synthetic lethal) 분석 등과 같은 유전자 기능 분석 및 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다.

분열효모 게놈 적중 라이브러리는 상동 재조합(homologous recombination)을 통해 각 표적 유전자를 selective marker (KanMX4)를 포함한 카세트로 치환하는 방법으로 제조되었습니다. 또한, 각 카세트에는 특이적인 barcode가 포함되어 있어 pooled library 상에서 다량의 유전자 기능 분석이 가능합니다.

- Heterozygous diploid deletion mutants 라이브러리의 경우 총 4,845개의 변이체로 구성되어 있고 이는 전체 게놈 (총 4,914개 ORF 포함)의 약 98%를 차지합니다.
- Homozygous haploid deletion mutants 라이브러리의 경우, 총 3,497개의 변이체로 구성되어 있습니다

각 균주들은 특이적인 barcode를 selection 마커 (KanMX4) 양쪽에 지니고 있으며, 이는 전체 균주 pool상에서 다량의 유전자 기능 분석 및 약물 타겟 스크리닝이 용이한 수단을 제공하고 있습니다. 또한, 각 개별 균주의 표현 형질을 분석함으로서 유전자의 기능을 규명하는데도 효과적으로 사용 가능합니다.

figure1



응용 분야


응용 분야 1. 항균제 대상 타겟 스크리닝

figure2

Figure 1. 항균제(Terbinafine)을 S.pombe deletion mutant library에 처리하여 기존에 알려진 타겟인 erg1 유전자를 확인하였고, 신규 타겟으로서 pmm1 유전자를 새로 발굴함.


응용 분야 2. 고지혈증 치료제 대상 타겟 스크리닝

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Figure 2. 고지혈증 치료제(simvastatin)의 타겟인 HMG1의 S.pombe ortholog인 hmg1 유전자를 타겟 스크리닝을 통해 확인함.



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