AccuTarget™ Predesigned siRNA

siRNA 는 주로 외부에서 유래한 이중 가닥 RNA 로, 표적 mRNA 에 완전한 상보적 결합을 통해 매우 특이적으로 하나의 유전자 발현을 억제합니다. 반면, miRNA 는 세포 내 유전자에서 전사된 단일 가닥 RNA 로, 표적 mRNA 부분 상보적으로 결합(seed region)하여 번역을 억제하거나, 분해 또는 절단을 유도하게 됩니다.

따라서, 하나의 miRNA 가 여러 mRNA 에 작용할 수 있으므로 다양한 유전자 발현을 조절하는데 관여합니다. siRNA 처럼 sequence 로 묘사되지 않고 고유의 miRNA ID 가 부여됩니다.

모든 siRNA 제품은 주문 확정 후 2~4일 후 제품을 받으실 수 있습니다. 추가적인 modification이 있을 경우 합성일정에 따라 변동됩니다.

Single strand RNA는 최대 85 mer까지 서비스 가능하며 siRNA는 30 mer까지 동일한 가격으로 제공해 드립니다.

30 mer 이상의 siRNA가 필요하신 경우 별도 문의(sirna@bioneer.co.kr) 바랍니다.

Genome-wide predesigned siRNA, Validation siRNA, siRNA Library, Control siRNA는 Sense와 Antisense 각각을 동일 농도로 정제(MALDI-TOF mass 확인)한 다음 "Annealing" 과정을 거쳐 Duplex형태로 건조 후 제공합니다. 이를 함게 동봉해 드리는 DEPC D.W에 원하시는 농도(100 μM로 권장함)로 녹여서 바로 실험에 사용하시면 됩니다.
Custom siRNA 주문 시 Annealing service를 신청하신 경우 Sense와 Antisense 각각을 동일 농도로 정제(MALDI-TOF mass 확인)한 다음 "Annealing"과정을 거쳐 Duplex로 건조 후 제공합니다. 이를 함께 동봉해 드리는 DEPC D.W.에 원하시는 농도(100 uM로 권장함)로 녹여서 사용하시면 됩니다. Annealing service를 신청하지 않으신 경우 annealing buffer(1X)를 이용하여 동봉되는 annealing protocol 대로 annealing하시면 됩니다.

한 가지 target gene 에 대해 RNAi 실험을 진행하실 때, 동일 target 을 대상으로 설계된 서로 다른 siRNA 들을 사용하여 실험하시는 경우가 있습니다. 이 때 각각의 siRNA 들을 따로 처리하지 않고 한꺼번에 처리하시고자 하는 경우, 서로 다른 siRNA 를 하나의 tube 에 mixture 로 제공하는데, 이를 pooling service 라고 하며 해당 서비스를 이용하실 경우 별도의 비용이 추가됩니다.

10 nmole scale의 siRNA를 100 nM로 transfection 한다면 6 well plate 기준으로 100개 well에 transfection할 수 있는 양입니다. 일반적인 세포 실험에서는 Bio-RP Purification을 선택하셔도 좋은 결과를 얻으실 수 있습니다.

네, 가능합니다. dA, dC, dG, dT를 원하시는 sequence로 DNA와 RNA가 섞여있는 chimeric RNA의 합성하실 수 있습니다. 또한 2'-O-Methyl 형태의 RNA와 2'-F(rA,rC,rG,rUrU, rC) RNA 합성도 가능합니다. 단 주문 시에는 웹상의 주문안내 manual을 따라 주문 진행하여 홈페이지에서 바로 주문 가능합니다.

검색되는 3개의 siRNA는 유전자 KD 효율이 높은 순서대로 -1,-2,-3으로 표기 되어 있습니다. 1개의 siRNA만 사용하실 경우 KD효율이 높은 -1 제품을 선택하시면 됩니다.

Bioneer의 Genome-wide predesigned siRNA의 경우 3개의 candidate까지만 제공합니다. 4개 이상의 candidate를 주문하고자 하시면 Custom siRNA으로 주문하시면 됩니다. siRNA의 sequence는 주문을 하셔야만 확인하실 수 있습니다. 논문에 나온 sequence와 비교하거나 Design 조건을 변경하고자 하실 경우 이메일(sirna@bioneer.co.kr) 로 연락주시면 신속하게 답변해드립니다.

주문하실 때 별도로 지시하지 않으면 5' 과 3' 위치에는 -OH 기가 붙어있습니다. 따라서 5 phosphate가 부착된 siRNA를 원하시면 5' phosphorylation modification된 siRNA를 주문하셔야 합니다.

siRNA의 다양한 응용을 위해서는 modified된 siRNA의 사용이 필요하며 siRNA를 modification 하기 위해서는 여러 가지 방법이 응용될 수 있으나 가장 간편한 것은 phosphoramidite 방법을 이용하여 siRNA 합성기를 통해 siRNA 상에 label을 부착합니다.

siRNA의 5'위치에 modification이 필요한 경우는 정해진 염기배열의 siRNA 합성이 완료된 후 label phosphoramidite를 사용하여 5'위치에 결합시킴으로써 결과적으로 siRNA의 5' 위치에 label을 부착하게 됩니다.

3'-Modification의 경우는 5'-modification 보다 복잡한데 일반적으로 label이 미리 부착된 고형 지지체로부터 siRNA 합성을 수행함으로써 3' 위치에 label이 부착된 siRNA를 합성할 수 있게 됩니다.

Deoxyuridine의 base의 5' 위치에 label을 도입한 phosphoramidite를 이용하면 siRNA 합성 시 원하는 sequence에 label을 도입할 수 있어 결과적으로 internal modified siRNA의 합성이 가능하게 됩니다.

다음은 저희 Bioneer에서 합성 제공하는 modified siRNA입니다.

• 5' Amine - 3' Amine Modification

• 5' Phosphorylation & 3' Phosphorylation

• 5' Thiol - 3' Thiol Modification

• 5' Biotin - Internal Biotin-dT Modification

• 5' Fluorescein - 3' Fluorescein Modification

• 3' TAMRA Modification

이상의 modification을 포함하여 100여종의 modification을 제공하고 있으니 홈페이지에서 원하는 modification을 확인하시어 주문하실 수 있습니다.

일반적으로 바이오니아에서 제공한 모든 siRNA 제품은 청정실에서 제작되어  -20℃에서 1년 이상 안정합니다. 특히 최초 제공해드린 건조 상태의 제품은 보다 안정적으로 보관하실 수 있습니다. 동봉한 DEPC-DW로 녹인 용액 상태의 siRNA는 공기 중의 RNAse를 포함하고 있는 에어로졸 입자가 들어가면  '얼렸다 녹였다' 과정에서 분해될 수 있어서 효능 저하를 보일 수 있으므로 합성 siRNA는 받으신 후에 clean bench에서 여러 개의 RNAse-free tube로 분주하여 각각을 보관하신 뒤 필요량만큼 따로 사용하시는 것이 바람직합니다. RNA의 경우는 pH 11 이상에서는 hydrolysis에 의해 phosphodiester bond가 깨질 수 있으니 주의를 요합니다.

용액 상태로 보관할 때에는 제품 발송 시 동봉하여 드리는 DEPC D.W.에 녹여두시면 더 오래 보관할 수 있습니다.

빛에 노출되면 형광이 약해질 수 있으므로 빛이 차단된 용기에 보관하시고 또 저장하는 장소도 빛이 들어오지 않는 장소에서 보관하시는 것이 좋습니다. Cyanine 3, Cyanine 5는 pH 9 이상에서는 degrade 될 수 있으므로 Cyanine 3, Cyanine 5 modified siRNA는 보관 시 basic 한 환경을 피하도록 하셔야 합니다.

합성 siRNA는 매우 미량이라 어느 정도의 양이 있는지 무게를 재서 알아내기는 매우 힘듭니다. 따라서 siRNA의 빛의 흡광도를 측정하여 간접적으로 합성 siRNA의 정량을 하게 되는데 이때 빛의 흡수량을 O.D. (Optical density) 값으로 표시합니다.

일반적으로 siRNA 합성은 Guarantee nmole 단위로 신청되며 합성된 결과도 보통 nmole 단위로 report 됩니다. 하지만, 사용하고자 하실 때 ng 또는 μg 단위로 하신다면 mole을 g으로 환산하시면 됩니다. Report에 siRNA의 분자량이 표시되기 때문에 쉽게 바꿀 수 있습니다.

분자량 M.W. (g) X mole 수 (nmole) = siRNA의 양 (ng)

우선 siRNA 합성 시트에 쓰여있는 'volume for 100 pmole/µl' 라는 말은 100 pmole/µl의 농도로 만들기 위해 첨가해야 할 DEPC D.W.의 양을 이야기합니다. 받으신 리포트 용지에 각각 100과 200라고 적혔다면, 각 oligomer tube에 적힌 대로 각각 DEPC D.W. 등을 100 µl와 200 µl를 각각 첨가했을 때 농도가 100 pmole/µl가 됩니다.

즉, 각 tube에는 siRNA가

100 μl x 100 pmole/μl = 10,000 pmole = 10 nmole,

200 μl x 100 pmole/μl = 20,000 pmole = 20 nmole

씩 들어 있습니다.

사용하시는 목적에 따라 siRNA의 농도를 알맞게 설정하여야 하지만, 일반적으로 실험의 경우 100 pmole/µl 농도로 녹였을 때 사용하기 편리하기 때문에, 본사에서 제공하는 sheet에는 농도를 100 pmole/µl로 만들기 위한 volume을 제공하는 것입니다.

첫째, 고효율의 siRNA 디자인은 sequence에 따른 여러 물리, 생화학적 요인들을 종합적으로 최적화한 프로그램에 의해 예측되기 때문에 실제 가장 효과 좋은 siRNA를 선별하기 위해서는 3개의  siRNA 후보들을 각각 실험을 통해 가장 효율이 높은 siRNA서열을 발굴해야 합니다.

둘째, 단백질 수준에서 siRNA 작용에 의한 억제효과를 정확히 확인하기 위해서는, 먼저 siRNA처리에 의해 타겟 유전자 mRNA가 분해되는지 real-time PCR을 통해 확인한 후 ELISA나 Western blot을 통해 단백질 발현 억제를 확인하시면 됩니다.

셋째, RNase 오염을 최소화해야 합니다. RNase는 피부, 실험용기뿐만 아니라 공기 중 바이오 에어로졸에 존재하고 있음으로 이러한 RNAse에 의해 분해된 siRNA을 사용할 경우 원하는 결과를 얻을 수 없습니다.

넷째, 실험에 사용할 세포의 상태를 건강하게 유지해야 합니다. 적절한 세포 수를 유지하여 Transfection reagent를 이용한 실험을 하셔야 합니다. 세포수가 너무 많으면 transfection 효율이 떨어질 수 있습니다.

다섯째, 대조군을 설정하는 것은 결과의 해석에 큰 도움이 됩니다. 양성대조군, 음성대조군, 그리고 형광 표지 siRNA는 실험과정에서 있을 수 있는 실수 혹은 실험 설계의 오류를 확인하는데 필수적입니다.

첫 테스트를 진행하시면서 siRNA의 치리 농도, 배양된 세포의 수, antibiotics의 제외 등의 추가 조건을 조정하는 방향으로 진행하시면 됩니다.

추가로 양성대조군, 음성대조군, 그리고 형광 표지 siRNA는 실험의 조건을 잡는 과정에서 결과 해석에 큰 도움을 줍니다. siRNA 실험에서 중요한 것은 siRNA가 Cell 내에 제대로 delivery 되는 것이므로, 기존에 transfection효율이 불확실한 세포주를 사용하는 경우, 반드시 형광 라벨링 된 scrambled siRNA인 NC-FITC을 양성대조군으로 하여 세포 내 전달을 확인하는 것이 중요합니다.

현재 Bioneer에서 판매되고 있는 Positive control이나 NC-FITC를 이용하여 간단하게 siRNA delivery를 모니터링하실 수 있습니다.

* Positive control : AccuTarget™ Positive Control siRNAs (Human GAPDH,GFP,Luciferase)

* Negative control : AccuTarget™ Negative Control siRNAs (Human, Mouse, Rat)

* NC-FITC : AccuTarget™ Fluorescein-labeled Negative Control siRNA

siRNA를 transfection하기 위한 cell density는 약 60-70% 정도가 적당합니다. (HeLa cell, 6-well plate 기준 : 1.5 x 10⁵ cells/well , 단 사용자의 조건에 따라 조절이 필요합니다.)

Starting concentration은 100 nM이며, 농도를 낮추어 가면서 실험하려는 세포 조건에 맞게 optimization 과정이 필요합니다. (100 pmol/well)

가장 많이 혼동하시는 부분입니다. siRNA를 100 nM로 6 well plate의 1 well에서 transfection 하실 때, Transfection 용액(배양 용액)의 volume이 1 ml이므로 100 nM(100 pmole/㎖)의 농도로 siRNA를 처리하려면 100 pmole수의 siRNA가 필요합니다. 50 μM(50 pmole/μl) stock의 siRNA를 2 μl 넣으면 100 pmole의 siRNA를 transfection한 것이 됩니다. 만약, 10 nmole 주문하시면 100 nM(100 pmole/ml) transfection시 100개 well에 사용하실 수 있습니다

실험하려는 세포조건에 따라 적합한 transfection reagent 사용을 권장합니다.

Cell line 마다 사용되는 reagent에 따라 siRNA 효율에 차이가 생길 수 있으니 각 제조사들의 기술자료들을 참고하여 사용하시면 됩니다.

NC-FITC를 transfection 후 형광현미경 관찰을 통해 transfection efficiency 확인이 가능합니다. 또한 NC-FITC는 siRNA와 transfection reagent의 사용농도 및 세포 조건의 확립 등 본 실험에 앞서 transfection 조건을 셋팅하기 위한 테스트 시약으로 사용될 수 있습니다.

Human과 Mouse, Rat에서 공통으로 사용 가능한 AccuTarget™ Negative control siRNA는 non-targeting siRNA로써, Human과 Mouse, Rat의 알려진 모든 유전자들에 대해 homology가 낮은 sequence입니다. 따라서 모든 유전자의 knockdown 실험에 negative control로 사용할 수 있어서 편리합니다.

AccuTarget™ Positive control siRNA(human)는 target gene에 대하여 높은 효율의 knockdown 효과가 확인된 siRNA 들입니다. 모든 세포에서 발현되는 house-keeping gene인 GAPDH에 대한 효율적인 siRNA를 제공하며 이를 통해 transfection 효율을 간접적으로 확인해 볼 수 있습니다. 이외에도 reporter gene으로 많이 사용되는 GFP와 Luciferase에 대해 고효율의 knock-down 효과를 보이는 siRNA들을 Positive Control siRNA도 판매하고 있습니다

qRT-PCR, Northern blot을 통해 mRNA degradation을 확인할 수 있고, Western blot 등의 실험을 통해 해당 단백질의 감소를 확인하실 수 있으며, 일반적으로 간편하고 정확하여 가장 널리 사용되는 분석법은 qRT-PCR을 통해 Negative control siRNA 대비 발현 저해 효율을 측정하는 방법입니다.

AccuTarget™ siRNA는 한국생명공학연구소와 BIONEER에 의해 개발된 고효율의 Turbo si-Designer algorithm에 의해 design 되었습니다.
모든 AccuTarget™ siRNA는 Real-Time PCR primer와 같이 set로 주문이 가능하고, 또한 10개 이상의 siRNA를 주문 시 flexible siRNA Library 형식으로 plate type으로 주문하실 수도 있습니다.

BIONEER의 주문 사이트에서 원하는 유전자의 이름 또는 Gene accession No.를 입력한 후 검색된 siRNA candidate를 선택하여 주문하실 수 있습니다. 원하는 유전자에 대하여 Predesigned siRNA 가 아닌 Custom siRNA으로 주문 시 Turbo si-Designer algorithm을 통한 siRNA 디자인 서비스가 가능하며 이메일 (sirna@bioneer.co.kr)을 통해 주문하실 수 있습니다. 단, 동일 유전자에 대하여 3개 이상의 candidate 주문 시에만 적용됩니다.

기본적으로 siRNA 와 miRNA은 20-23 mer의 RNA duplex 로 구성되어 있습니다. 따라서, 거의 모든 miRNA 실험은 siRNA 실험과 동일한 방식으로 진행이 됩니다. 그 외 miRNA 에만 적용할 수 있는 사안에 대해서는 아래를 참조하시기 바랍니다.

MirBase(http://www.mirbase.org) 22Version에서 확인 가능합니다. 다만, 새로운 miRNA 들이 계속 update 되고 있기 때문에, 새로 발굴되는 miRNA 의 경우 주문을 하시려면 custom siRNA주문을 통해 주문하시기 바랍니다.

문헌에 따라 다소 상이한 내용이 보고 되어 있습니다. miRNA의 기능이 cell context에 따라 다르다는 보고와, 반대로 세포의 종류와 상관없이 동일하다는 보고가 있습니다. 보다 자세한 내용은 관련 문헌 내용을 참조하시기 바랍니다. (Reference : 1-4)

miRNA 는 단순히 존재하는 것만으로 기능하는 것이 아니라, target mRNA 의 단백질 발현을 억제하는 것이 핵심 기작이므로 Western blot 으로 단백질 발현량을 확인하는 방법이 miRNA 의 기능적 효과를 가장 정확하게 평가하는 방법입니다.

또는 target mRNA 의 3’UTR 의 miRNA binding site 가 포함된 luciferase vector 를 이용하여 luciferase assay 를 진행합니다. Western 또는 luciferase assay protocol 은 적절한 문헌을 참조하시기 바랍니다. (Reference: 5)

miRNA 가 몇몇 mRNA 분해를 유발하는 것으로도 알려져 있기 때문에, mRNA 에 따라서는 qPCR 로 효과를 측정하기도 합니다.
miRNA 자체의 발현량을 qPCR 로 확인하는 방법인 miRNA qPCR 은 miRNA가 제대로 도입되었는지 검증하는 보조 실험으로 사용하는 것을 권장 드립니다.

miRNA도 siRNA와 마찬가지로 형광 라벨링을 통해 transfection 효율을 체크해 볼 수 있습니다. 형광 label된 miRNA를 원하실 경우 custom siRNA로 주문하실 수 있습니다. 주문 시에 miRNA의 활성을 가지는 strand에 형광을 붙일 경우 miRNA의 기능이 상실될 수 있으므로 가능하면 반대 strand에 형광을 붙이는 것이 좋습니다.

miRNA mimic 은 miRbase(http://www.mirbase.org)를 통해 확인된 서열 정보를 기반으로 화학적으로 합성된 mature miRNA 입니다. Transfection 후에는 세포에 실제 존재하는 endogenous miRNA 와 같은 활성을 나타내도록 설계되어 있으므로 같은 기능을 한다고 볼 수 있습니다.

당사에서는 miRbase Ver.22 를 기반으로 합성되고 있으며, 다른 버전의 miRNA가 필요하실 경우 이메일 (sirna@bioneer.co.kr) 로 문의 해주시면 됩니다.

miRNA mimic 과 inhibitor 각각의 negative control 제품 사용하시면 됩니다.
제품 링크: AccuTarget™ miRNA Negative Control, BioRP (https://www.bioneer.co.kr/20-smc-2001-cfg.html)
                AccuTarget™ Fluorescein-labeled miRNA Negative Control, HPLC (https://www.bioneer.co.kr/20-smc-4001-cfg.html)

miRNA mimic 은 mature miRNA를 화학적으로 합성한 것으로 생체 내의 miRNA 와 같은 역할을 하도록 제조된 Double-strand RNA 입니다.
miRNA inhibitor 은 target miRNA 의 활성을 저해하는 역할을 하기 위해 miRNA 에 강하게 hybrid 형성하는 방식으로 작동하는 Single-stranded RNA 입니다.

Transfection 등 제품의 사용 방법과 관련된 사항에 대해서는 홈페이지에 공개되어 있는 매뉴얼과 프로토콜을 참고하시어 진행하시면 됩니다.