CRISPR

AccuTool ™|Accurate Tool of CRISPR-Cas9 System

Global Leader in Genome Editing Technology

CRISPR-Cas9 기술은 1세대 ZFN (Zinc Finger Nuclease), 2세대 TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)보다 경제적이고 효율적인 강력한 3세대 Genome Editing Tool입니다. CRISPR-Cas9 시스템은 target DNA를 정확하게 인식하고 결합하는 guide RNA와 target DNA를 절단하는 Cas9 nuclease로 구성되어 DNA 이중 가닥을 손상시키고 이것을 복구하는 과정을 통해 유전자를 조작할 수 있습니다. 바이오니아는 유전자 편집 기술을 선도하고 있는 툴젠과 협력하여 런칭한 AccuTool™을 통해 gRNA 디자인부터 합성, Cas9 nuclease, Validation까지 Genome Editing 전반의 Total Solution을 제공합니다.

Overview

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9 기술은 미생물의 적응면역 현상에서 기인한 유전자 편집 기술로, target DNA를 정밀하게 잘라낸 다음 자연적으로 DNA가 복구되도록 함으로써 보다 간단하고 효율적으로 유전자 조작을 가능하게 합니다. 이 시스템은 gRNA (guide RNA)와 Cas9 nuclease로 구성되며, RNA 유전자 가위 (RNA-guided engineered nucleases, RGENs) 기술이라고도 불립니다.
gRNA는 target 서열에 상보적으로 결합하는 crRNA와 Cas9-binding을 위한 tracrRNA로 구성됩니다(Figure 1). gRNA는 Cas9을 target 부분으로 안내하는 역할을 하며, target DNA 서열과 상보적으로 결합합니다. Target DNA 서열 3’ 말단에는 PAM (Protospacer adjacent motif) 서열이 있어야 합니다.
gRNA가 Cas9 nuclease와 복합체를 형성하고 target 서열에 특이적으로 결합하면, Cas9 nuclease는 PAM 서열을 인식하고 PAM의 3 bp upstream 부분에 이중 가닥 손상(Double Strand Break, DSB)을 일으킵니다(Figure 2).

Figure 1. gRNA와 Cas9 nuclease
gRNA는 target 특이적인 서열인 crRNA와, Cas9과 복합체를 이루는 scaffold 서열인 tracrRNA로 구성됩니다.
Figure 2. CRISPR-Cas9 system
RNA-guided Cas9이 target 서열 3’ 말단에 있는 PAM 서열 (5’-NGG-3’)을 인식하고 3 bp upstream 부위에 DSB를 형성합니다.

DSB로 인해 손상된 DNA를 복구하기 위하여 세포는 일반적으로 두 가지의 경로를 거치게 됩니다: Non-homologous end-joining (NHEJ) 또는 Homology-directed repair (HDR) pathway.
Donor template이 없는 경우 NHEJ pathway를 통해 DSB가 재조립되며, 유전자 coding region 내에 Indel (Insertion and deletion) 생성으로 인한 frameshifts 및 premature stop codon으로 유전자 Knock-Out이 만들어집니다. 반면, HDR pathway는 Donor template에 의해 정밀하고 정확한 수정 및 새로운 유전자를 삽입할 수 있습니다(Figure 3).

Figure 3. CRISPR-Cas9-mediated DSB repair mechanisms
DSB repair 메커니즘에는 NHEJ와 HDR pathway가 있습니다. NHEJ pathway는 DSB의 말단을 연결하는 과정에서 일부 염기가 삽입되거나 결실되어 Indel (Insertion and deletion) 변이를 만듭니다. HDR pathway는 Donor DNA (dsDNA Donor 또는 ssDNA Donor)의 homologous 서열을 통해 정확한 유전자 삽입이 가능합니다.

CRISPR-Cas9 실험 가이드

(링크를 클릭하면 해당 제품 페이지로 이동합니다.)

STEP 1

유전자 편집은 gRNA를 디자인하여 Cas9 nuclease를 target DNA 서열로 유도함으로써 시작됩니다.

STEP 2

RNA-guided Cas9 nuclease에 의해 절단된 DSB의 복구를 위한 방법 중 NHEJ pathway를 이용하기 위해서 gRNA와 Cas9 nuclease를 실험에 맞게 합성 및 선택하여 target 세포에 바로 transfection이 가능한 형태로 제공합니다.
- RNP (AccuTool aRGEN)
Plasmid (AccuTool dRGEN)
2-Part gRNA (AccuCRISPR)

STEP 3

DSB의 복구를 위한 또 다른 pathway인 HDR을 이용하기 위해서는 Donor template를 디자인한 후 gRNA, Cas9 단백질과 함께 target 세포에 transfection하여 정밀한 수정을 진행해야 합니다.
- Donor synthesis

+ 검증되어진 gRNA와 HDR Donor vector를 이용하여 human AAVS1 유전자 부위/ mouse ROSA26 유전자 부위에 원하는 유전자를 삽입할 수 있는 AccuTool™ Safe Harbor Knock-In Kit 또한 만나볼 수 있습니다.

+ CRISPR 실험을 처음 진행한다면 실험에 필요한 모든 Materials와 Protocol을 받아볼 수 있는 All-In-One Kit인 AccuTool™ CRISPR/Cas9 Starter Kit를 추천합니다.

STEP 4

마지막으로, Mutation Detection Kit 또는 NGS 서비스를 통해, 제작된 gRNA의 유전자 편집 효율성을 평가할 수 있는 Validation 서비스를 제공합니다.

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